Niesprawdzona formuła zmienia go w niebezpiecznego „Jaszczura”. Denis Leary jako George Stacy, ojciec Gwen, kapitan policji, który ściga zarówno Spider-Mana, jak i Jaszczura. Campbell Scott jako Richard Parker, ojciec Petera, mąż Mary. Irrfan Khan jako Rajit Ratha, dyrektor Oscorp i bezpośredni przełożony Connorsa. Martin Sheen jako Ben Parker, wujek Petera, mąż May. Sally Field jako May Parker, ciocia Petera, żona Bena.
Ponadto w filmie wystąpili: Embeth Davidtz jako Mary Parker, matka Petera i żona Richarda; Kari Coleman jako Helen Stacy, matka Gwen i żona George’a; Chris Zylka jako Flash Thompson, kapitan licealnej drużyny koszykówki Midtown Science High, który dręczy Parkera; Hannah Marks jako Missy Kallenback, nieśmiała koleżanka Parkera, która się w nim podkochuje; Leif Gantvoort jako włamywacz, który zabił Bena Parkera oraz Michael Massee jako Gustav Fiers, tajemniczy mężczyzna, z którym Connors rozmawiał w więzieniu. W roli cameo pojawił się twórca postaci, Stan Lee.