Knuth początkowo wiązał swoją przyszłość z muzyką, jednak ostatecznie zdecydował się studiować fizykę na Case Institute of Technology w Cleveland (znanym teraz jako Case Western Reserve University) w stanie Ohio. Na studiach pierwszy raz poważnie zetknął się z matematyką, która wyparła jego początkowe zainteresowanie fizyką. Upewniły go w tym sukcesy w tej dziedzinie na Case. Wtedy też pierwszy raz miał kontakt z komputerem, był to IBM 650. W 1960 uzyskał tytuł bakałarza (Bachelor of Science), a następnie magistra (Master of Science).
Od 1960 do 1963 roku studiował na California Institute of Technology (Caltech), zdobywając w wieku 25 lat stopień doktora matematyki za pracę Finite semifields and projective planes.
Działalność naukowa W czasie studiów na Caltech napisał pracę An imaginary number system, w której wprowadził system liczbowy o podstawie z liczby zespolonej 2i. Po otrzymaniu stopnia doktora na Caltechu, pracował tam najpierw jako assistant professor, a w 1966 jako associate professor. W latach 60. pracował m.in. dla Burroughs Corporation jako konsultant i jako redaktor działu Języki Programowania organizacji ACM. W 1968 został profesorem na Uniwersytecie Stanforda. Wykładał informatykę, inżynierię elektryczną, matematykę na takich uczelniach jak Uniwersytet Stanforda, Uniwersytet w Oslo, Uniwersytet Oksfordzki.