Za panowania Roberta II ustanowiono zasadę, że korona miała przechodzić kolejno na męskich potomków monarchy, a kobiety mogły ją dziedziczyć wyłącznie w przypadku wygaśnięcia linii męskiej. Ponieważ wszystkie męskie linie Stuartów wymarły przed śmiercią Jakuba V, prawa do tronu przypadły jego córce. Mając zaledwie sześć dni, Maria została królową Szkocji. Funkcję regenta objął James Hamilton, 2. hrabia Arran, sprawujący władzę do 1554 roku, kiedy zastąpiła go matka królowej. Maria de Guise pełniła regencję aż do swojej śmierci w 1560 roku.
W lipcu 1543 roku zawarto traktat z Greenwich, na mocy którego Maria została zaręczona z synem Henryka VIII. Jeszcze w tym samym roku planowano realizację jego postanowień, jednak matka królowej, przeciwniczka tego mariażu, ukryła się wraz z dzieckiem w zamku w Stirling, gdzie rozpoczęto także przygotowania do koronacji młodej władczyni.
Maria została koronowana na królową Szkotów 9 września 1543 roku w kaplicy królewskiej na zamku w Stirling.