Służba operacyjna Po wejściu do służby U-64 został wysłany do Kilonii, gdzie miał przejść próby i szkolenia na Bałtyku. Były one utrudnione przez silne zimowe sztormy i mrozy. Od początku marca wszedł w skład frontowej , stacjonującej w Wilhelmshaven. 6 kwietnia 1940 roku opuścił bazę, wypływając na swój jedyny patrol bojowy na Morze Północne i do brzegów Norwegii. W pierwszych dniach rejsu miał eskortować krążownik pomocniczy „Orion”, płynący prowadzić działania rajderskie na Atlantyku. 9 kwietnia dowódca U-64 otrzymał zakodowany rozkaz, zgodnie z którym miał płynąć ku brzegom Norwegii i zająć pozycję w rejonie Narwiku, dla wsparcia rozpoczynającej się inwazji na ten kraj.
U wejścia do fiordu West U-64 podjął nieudaną próbę ataku na brytyjski niszczyciel, ale został wykryty i zmuszony do zejścia na głębokość ponad 80 metrów. Podczas następnej próby ataku na brytyjskie jednostki patrolujące rejon fiordu obie wystrzelone torpedy eksplodowały przedwcześnie. Wykonywanie kolejnych uników w wąskich wodach fiordu wyczerpało baterie akumulatorów, dlatego gdy po odpłynięciu kontratakujących Brytyjczyków U-64 wypłynął na powierzchnię, był chwilowo niezdolny do ponownego zanurzenia. Eskortowany przez U-25 wpłynął do portu w Narwiku. Tam otrzymał dalsze rozkazy i przetrwał brytyjski nalot.