Klasztor miał też odegrać znaczącą rolę w tzw. misji ruskiej, prowadzonej od 1453 z inicjatywy króla Kazimierza Jagiellończyka i św. Jana Kapistrana. Miała ona na celu utwierdzanie w wierze ludności katolickiej i nawracanie ludności prawosławnej na terenie Rusi Czerwonej.
Przyjęcie fundacji miało miejsce w 1465. Zakon reprezentował o. Marek z Bolonii, wikariusz generalny i o. Jakub z Głogowa, wikariusz prowincji. Zakonnicy przybyli do Przeworska prawdopodobnie z klasztoru w Tarnowie. Ukończyli oni wkrótce budowę kościoła, który otrzymał wezwanie św. Barbary z Nikomedii, dziewicy i męczennicy, oraz wznieśli zabudowania klasztorne. Klasztor w Przeworsku był dziesiątym z kolei kościołem bernardyńskim w Polsce i pierwszym na terenie diecezji przemyskiej.
XV–XVI wiek U schyłku XV wieku w klasztorze mieszkało 23 zakonników. W tym czasie dwóch kapłanów zmarło tu w opinii świętości: o. Piotr Kandyd i o. Grzegorz z Nowego Sącza. W 1489 odbył się tu kapituła prowincji polskiej, której przewodniczył bł. Władysław z Gielniowa. Ze względu na zagrożenie najazdem tatarskim rozpoczęto wznoszenie murów obronnych. Już w 1498 klasztor posłużył jako miejsce schronienia dla okolicznej ludności. Jednak do budowy właściwych obwarowań przystąpiono w 1506.