Klęska ewangelików w bitwie pod Mühlbergiem zmusiła Nikolausa von Amsdorfa do opuszczenia Naumburga i schronienia się w Weimarze. Podczas pobytu w księstwie Saksonia-Weimar założył Uniwersytet w Jenie, stojący w opozycji do nauk Melanchtona głoszonych na uniwersytecie w Wittenberdze. W tym samym duchu wydał zebrane dzieła Lutra, uzasadniając to koniecznością poprawy błędów i ominięć w wydaniu wittenberskim.
W 1552 von Amsdorf został superintendentem Eisenach, gdzie pozostał do śmierci.
Poglądy Wraz z Flaciusem prowadził polemikę przeciwko tzw. filipistom i adiaforytom. Krytykował Filipa Melanchtona i Martina Bucera za ich ugodowość w stosunku do innych protestantów i książąt katolickich. W 1557 za jego sprawą doszło w Wormacji do formalnego zerwania pomiędzy stronnictwem nauk Lutra a zwolennikami nauk Melanchtona.
W latach 1554–1559 von Amsdorf toczył spór z Justusem Meniusem na temat roli uczynków w usprawiedliwieniu. W czasie tego sporu doszedł do radykalnego przekonania, że dobre uczynki są w istocie szkodliwe dla zbawienia. W wyniku tego przekonania w 1561 Flaciusa wygnano z Jeny;