Od 4 września 2006 do 9 stycznia 2007 był ministrem sprawiedliwości i przewodniczącym Rady Legislacyjnej w pierwszym rządzie Mirka Topolánka, następnie zaś od 9 stycznia 2007 do 8 maja 2009 ministrem sprawiedliwości w jego drugim gabinecie. 13 lipca 2010 ponownie objął funkcję ministra – tym razem w rządzie Petra Nečasa. 27 czerwca 2012 został zdymisjonowany przez premiera Petra Nečasa, którego oficjalne uzasadnienie tej decyzji (rzekome nieprzestrzeganie ograniczeń budżetowych przez ministra) było wielokrotnie kwestionowane przez media i polityków.
W 2014 Jiří Pospíšil wystąpił z Obywatelskiej Partii Demokratycznej, podejmując współpracę z ugrupowaniem TOP 09. W tym samym roku z listy koalicji TOP 09 i STAN uzyskał mandat eurodeputowanego VIII kadencji. W listopadzie 2017 został nowym przewodniczącym partii TOP 09. W wyborach lokalnych w 2018 i 2022 uzyskiwał mandat radnego Pragi.
W 2019 z powodzeniem ubiegał się o reelekcję w wyborach europejskich. W listopadzie tegoż roku na czele partii zastąpiła go Markéta Pekarová Adamová. Mandat posła do PE wykonywał do 2024.