Rozgrywka The Great Giana Sisters to dwuwymiarowa gra platformowa, w której gracz kieruje postacią idącą od lewej do prawej strony. Gra składa się z 33 poziomów. Oprócz rozgrywki jednoosobowej posiada ona tryb dla dwóch graczy, w którym obaj naprzemiennie sterują siostrami aż do utraty wszystkich punktów życia przez jedną z postaci. Akcja gry rozgrywa się we śnie dwóch sióstr: Giany i Marii, które muszą pokonać wielu wrogów i wybrnąć z niebezpiecznych sytuacji na swojej drodze, by zdobyć ogromny diament. Po dotarciu do celu okazuje się, że wszystko było rzeczywiście snem.
Celem gry jest przejście na drugą stronę planszy przed upływem ustalonego w danym poziomie czasu. W trakcie rozgrywki gracz zbiera punkty, przyznawane na przykład za zdobywanie diamentów, pokonywanie przeciwników i zbieranie power-upów ułatwiających rozgrywkę. Gracz ma trzy życia, które traci w wyniku kontaktu z przeciwnikami bądź elementami terenu takimi, jak woda, ruchome piaski czy ogień.