W mieście Meksyk uczył teologii w miejscowej Alma Mater. Podróżując na mule z Vera Cruz do stolicy zranił się w nogę. Rana nie zagoiła się do końca życia, co miało znaczenie, biorąc pod uwagę fakt, iż większość podróży misjonarskich przyszły błogosławiony odbywał pieszo. Serra poprosił o wysłanie go do pracy misyjnej w Sierra Gorda na północy Meksyku. W misji tej zakonnik przebywał dziewięć lat. Nauczył się lokalnego dialektu i przetłumaczył z hiszpańskiego katechizm. Następnie został odwołany do stolicy, gdzie zasłynął jako kaznodzieja i spowiednik. W tym okresie rozpoczął praktykę ostrego umartwienia.
W 1767 został mianowany przełożonym grupy piętnastu misjonarzy franicszkańskich, którzy mieli podjąć się pracy apostolskiej w Dolnej Kalifornii. Franciszkanie mieli przejąć placówki misyjne po wypędzonych z Nowej Hiszpanii przez Karola III 3 lutego 1768 jezuitach. Serra wsiadł na statek odpływający do Kalifornii 12 marca 1768 w porcie San Blas nad Oceanem Spokojnym. Na początku 1769 towarzyszył gubernatorowi Gasparowi de Portolá w wyprawie do Nowej Kalifornii. Po drodze założył jedyną franciszkańską misję na terenie Dolnej Kalifornii - San Fernando. Gdy ekspedycja dotarła do San Diego 1 lipca 1769, Serra zatrzymał się, by założyć misję San Diego de Alcalá - pierwszą z 21 założonych przez siebie w Kalifornii.