Cerkiew ta została wzniesiona z drewna blisko monasteru Świętej Trójcy, z którym związane było bractwo, i otrzymała wezwanie Ducha Świętego.
Po przekazaniu cerkwi i klasztoru Świętej Trójcy unitom bractwo przeniosło swoją siedzibę oraz drukarnię (wkrótce zamkniętą po publikacji kolejnej pracy polemicznej) na teren budynków sąsiadujących z cerkwią Świętego Ducha. Tam też z jego inicjatywy powstał męski monaster, którego pierwszym przełożonym został drukarz w pracowni bractwa, Longin Karpowicz, który przybrał imię zakonne Leoncjusz. Po jego śmierci w 1620 godność tę objął (pełnił ją do przyjęcia unii w 1625) inny dawny członek bractwa Melecjusz (Smotrycki). Podstawę wspólnoty stanowili mnisi, którzy nie chcieli przyjąć unii i w związku z tym zbiegli z monasteru Świętej TrójcyA. Radziukiewicz, Lament na śmierć archimandryty wileńskiego, Przegląd Prawosławny, nr 4 (202). Monaster utrzymywał się z pracy mnichów w sadzie i gospodarstwie oraz dzięki pomocy świeckich ofiarodawców, rekrutujących się głównie z szeregów szlachty należącej do bractwa Świętego Ducha, jak podkomorzy trocki Bogdan Ogiński. Po 1611 działająca przy nim cerkiew była jedyną czynną prawosławną świątynią w mieście i równocześnie centrum przeciwników unii.