Po śmierci pierwszego męża 11 kwietnia 1525, Małgorzata wyszła za Henryka II, króla Nawarry. Ślub odbył się 24 stycznia 1527 w Saint-Germain-en-Laye. Urodziła mu córkę, Joannę d’Albret (królową Nawarry, żonę Antoniego de Burbon-Vendôme i matkę króla Francji Henryka IV).
Jej pierwszy i jedyny syn, Jan, urodził się w Blois w lipcu 1530 roku, kiedy Małgorzata miała 38 lat i według szesnastowiecznych standardów wkraczała już w wiek podeszły. Dziecko zmarło jednak w Dzień Bożego Narodzenia tego samego roku. Uczeni wierzą, że to właśnie jej żal spowodował rozpoczęcie prac nad jej najbardziej kontrowersyjnym dziełem, Miroir de l'âme pécheresse (Zwierciadło grzesznej duszy) w roku 1531. Teolodzy z Sorbony potępili utwór jako herezję, a jeden z mnichów powiedział, że Małgorzata powinna zostać zamknięta w torbie i wrzucona do Sekwany. Studenci z Uczelni Nawarry wyszydzali ją w sztuce jako „wściekłość piekieł”. Jej brat wymusił jednak unieważnienie zarzutu i przeprosiny z Sorbony.