Mk I – Typ 300 W 1937 przystąpiono do produkcji wersji seryjnej Spitfire Mk I. Bazowała ona ma maszynie prototypowej. Wzmocniono w niej konstrukcję skrzydła, zwiększono zapas paliwa oraz zmodyfikowano kąt wychylenia klap. Napęd stanowił silnik Rolls-Royce Merlin II o mocy 1030 KM oraz dwułopatowe drewniane śmigło, takie samo jak w prototypie. Silnik ten, w porównaniu do silnika głównego przeciwnika, czyli silnika Daimler-Benz DB601 w Messerschmitt Bf109E, miał jedną podstawową wadę, ze względu na konstrukcję gaźnika, nie mógł pracować przy ujemnych przeciążeniach, co z kolei odbijało się na zdolnościach manewrowych samolotu. Podpisano kontrakt na produkcję 1000 samolotów. Pierwszy seryjny egzemplarz oblatano 15 maja 1938 roku. Do końca października 1939 zamówiono łącznie 4000 egzemplarzy. Jeden samolot tego typu zakupiła w celach badawczych i porównawczych także Polska. Maszyna wysłana w sierpniu 1939 nigdy jednak do Polski nie dotarła. Już na początku produkcji zamiast ręcznego chowania podwozia wprowadzono mechanizm chowania elektryczny i zmieniono rozrusznik. Od 78 wyprodukowanego egzemplarza w samolotach Spitfire zaczęto stosować trójłopatowe, metalowe śmigła deHavilland, o zmiennym skoku. A od 175 egzemplarza silniki Rolls-Royce Merlin III o tej samej mocy, które mogły napędzać trójłopatowe śmigła deHavilland albo Rotol.