W trakcie operacji „Pustynna Burza” w Iraku w 1991 roku Stratofortressy zrzuciły około trzydziestu procent (pod względem łącznego wagomiaru) bomb zrzuconych przez całą koalicję (w toku działań bojowych stracono jedną maszynę, lecz nie w wyniku działań nieprzyjaciela). Zastosowano je bojowo również w operacji bombardowania Jugosławii przez NATO w 1999 („Allied Force”), w operacji w Afganistanie („Enduring Freedom”, 2001), a także w drugiej wojnie irackiej („Iraqi Freedom”) w 2003 roku. B-52 zwalczały także cele związane z tzw. Państwem Islamskim w Iraku i Syrii w ramach operacji Inherent Resolve od 2016 roku.
Obecnie (2018) B-52 są zgrupowane w dwóch stałych bazach: w Dakocie Północnej (5. Skrzydło Bombowe) i w Luizjanie (2. Skrzydło Bombowe). Ponadto często działają tymczasowo z różnych baz sił powietrznych Stanów Zjednoczonych na całym świecie.
Zastosowanie niebojowe Dwie maszyny (NB-52A i NB-52B) uczestniczyły w amerykańskim programie eksperymentalnym X-15, jako nosiciele samolotów rakietowych X-15.