W 1919, projektując sieć parafii prawosławnych na Lubelszczyźnie, Ministerstwo Wyznań Religijnych i Oświecenia Publicznego nie planowało otwarcia cerkwi w Horostycie. O zgodę na użytkowanie budynku ubiegali się zarówno prawosławni, jak i katolicy, którzy powoływali się na unickie pochodzenie świątyni. Ostatecznie cerkiew w Horostycie została otwarta jako prawosławna w 1923. Należała do dekanatu włodawskiego diecezji warszawsko-chełmskiej i była jedną z ośmiu czynnych cerkwi w powiecie włodawskim. W dwudziestoleciu międzywojennym do cerkwi regularnie uczęszczało ok. 150 osób, tj. połowa wszystkich prawosławnych mieszkańców wsi. W czasie II wojny światowej świątynia była ciągle czynna. Według danych z 1943 była siedzibą jednej z trzynastu parafii tworzących dekanat lubelski diecezji chełmsko-podlaskiej.
Po 1947 mały|Dzwonnica cerkiewna, widok od strony cmentarza parafialnego (od północy) Cerkiew w Horostycie została zamknięta w 1947 z powodu braku wiernych, gdyż ci zostali wywiezieni w ramach wskutek Akcji „Wisła”. Starostwo Powiatowe Włodawskie wydało w tym samym roku zakaz tworzenia parafii prawosławnej w Horostycie;