Kolejne porozumienie pomiędzy monarchami w sprawie małżeństw ich dzieci zostało podpisane 3 stycznia 1496 równocześnie przez Maksymiliana w Nördlingen i Ferdynanda Katolickiego w Ulldecona. Ślub Małgorzaty i Jana nastąpił dopiero 3 kwietnia 1497 w Burgos. Małżeństwo trwało krótko, gdyż Jan zmarł 4 października 1497 w Salamance. Małgorzata była wówczas w ciąży. Dziecko urodziło się martwe. We wrześniu 1499 uzyskała zgodę na opuszczenie Hiszpanii i przez Francję udała się do Flandrii. Po przybyciu do Gandawy została 7 marca 1500 matką chrzestną swojego bratanka, późniejszego cesarza Karola V.
Już w styczniu 1498 cesarz Maksymilian zaczął planować małżeństwo Małgorzaty z księciem Sabaudii. Było ono elementem jego antyfrancuskiej polityki. 26 września 1501 Filip I Piękny podpisał w Brukseli kontrakt ślubny. 27 października 1501 Małgorzata odjechała do Sabaudii, gdzie 3 grudnia w klasztorze Romainmôtier poślubiła księcia Filiberta II. W Sabaudii Małgorzata wykazała się talentem politycznym, doprowadzając do pozbawienia wpływów i wygnania przyrodniego brata męża – René.
Książę Filibert zmarł w 1504 w wyniku wypadku na polowaniu. W 1506 Małgorzata założyła klasztor w Brou jako miejsce spoczynku męża.