Po wybuch II wojny światowej, 1 września 1939 zgłosił się do służby wojskowej. 22 września objął dowództwo nad improwizowanym zgrupowaniem „Brzoza”, które zorganizował z różnych oddziałów zapasowych w rejonie Małoryty. 25 lub 26 września wraz ze swoim zgrupowaniem podporządkował się dowódcy Samodzielnej Grupy Operacyjnej „Polesie” gen. Franciszkowi Kleebergowi. 28 września po włączeniu w jego skład zgrupowania „Drohiczyn Poleski” całość została formalnie nazwana 50 Dywizją Piechoty Rezerwowej. Dowodził tą dywizją w czasie bitwy pod Kockiem. Po kapitulacji SGP „Polesie” wzięty do niewoli niemieckiej, z których został rychło zwolniony, ze względu na swoje czeskie pochodzenie. W połowie października powrócił do Zielonki.
thumb|Grób gen. Ottokara Brzozy-Brzeziny na Cmentarzu Wojskowym na Powązkach w Warszawie W czasie okupacji prowadził firmę budowlaną. Od listopada 1939 nawiązał kontakt z Komendą Główną SZP. Jego majątek pełnił rolę konspiracyjnego ośrodka Okręgu Warszawskiego SZP, a następnie ZWZ-AK. W 1943 powstała w nim baza szkoleniowa dla podoficerów batalionu terytorialnego AK „Dęby”. Ottokar Brzoza-Brzezina czynnie współpracował z wywiadem AK. W swoim folwarku ukrywał także grupę Żydów. W 1944 został aresztowany przez Niemców i wywieziony do Oflagu IIC Woldenberg.