W latach 1524–1525 ponowili oni próbę eksploracji odkrytych terenów, lecz z powodu oporu Indian oraz problemów z zaopatrzeniem musieli zawrócić. Było to przedsięwzięcia prywatne. Koszty pokryli trzej wspólnicy, dwaj konkwistadorzy oraz ksiądz Hernando de Luque, będący agentem Espinozów, bogatej kupiecko-urzędniczej rodziny.
Przy drugiej próbie zbadania odkrytych terenów, dysponowano kapitałem 20 tys. pesos. Pozwoliło to na zwerbowanie 160 ludzi oraz zakup ekwipunku dla dwóch statków. Podczas ekspedycji natknięto się indiańską tratwę kupiecką przewożącą wyroby ze złota, srebra i tkanin, co utwierdziło konkwistadorów o istnieniu cywilizacji na tamtych terenach. Konkwistadorzy spenetrowali ląd aż do północnych wybrzeży Ekwadoru i ostatecznie z braku zaopatrzenia wylądowali na wyspie koguciej (Isla del Gallo) w zatoce Tumaco. Pizarro zdecydował się wysłać Almagra do Panamy po posiłki i prowiant. Hiszpański gubernator Pedro de los Rios dowiedziawszy się o położeniu konkwistadorów, wysłał statek z nakazem natychmiastowego powrotu wszystkich uczestników wyprawy. Pizarro miał nakreślić linię mieczem, wzywając tych, którzy chcą dzielić z nim bogactwo i sławę, aby zostali po jego stronie, a druga część niech wraca, wybierając nędzę w Panamie. Pizarro wraz z kilkunastoma towarzyszami przeniósł się na wyspę Gorgona, gdzie spędził ok.