W 1587 roku wyruszył na drugą wyprawę, trwająca ponad dwa lata. W tym czasie zbadał zachodnie urwiska Wyżyny Gujańskiej. W 1590 zorganizował kolejna wyprawę, z którą na czele 118 żołnierzy, 200 Indian oraz z własnym 13 letnim synem Franciskiem, wyruszył pod prąd rzeki Orinoko. Gdy dodarli do ujścia rzeki Caury, zatrzymała ich pora deszczowa, po której pozostało jedynie 50 zdrowych ludzi. Z nimi wdarł się na wyżynę, a następnie kierując się na południe przez dżunglę, dotarli do rzeki Ventuari i spływając nią na skleconych kanoe dotarł do Orinoko, a następnie do ujścia rzeki Mety i Cuary. Tam Antonio de Berrio postanowił zbadać ostatnią rzekę płynącą przez Wyżynę Gujańską i wpadającą do Orinoko – Caroní. Kazał pozabijać wszystkie konie a ich mięso zasolić. Następnie spłynął do Caroni, lecz po drodze większość jego załogi oślepła w wyniku jaglicy. Pozostawiając chorych na wyspie na rzece Orinoko, sam z garstką ludzi popłynął na Trynidad po posiłki.