Budowa geologiczna i ukształtowanie powierzchni Dolina zbudowana jest głównie z wapieni z okresu górnej jury i kredy (150 mln lat). Grubość warstw tych skał dochodzi do 200 m. W niektórych miejscach pokryte są one warstwą lessu. W wapieniach tych bardzo dobrze rozwinęły się zjawiska krasowe. Powstały liczne jaskinie (ok. 300), wąwozy i jary z wywierzyskami, bramy skalne, iglice i ostańce o fantastycznych kształtach. Wystające nad powierzchnię formy skalne zbudowane są ze skalistych wapieni o dużej twardości i zwięzłości, położonych pomiędzy bardziej miękkimi wapieniami ławicowymi. Wśród skamieniałości najczęściej występują gąbki i ramienionogi, bardzo rzadko spotyka się amonity.
Dolina powstała głównie w wyniku erozyjnego działania płynącej jej dnem wody. Na jej zboczach obserwować można terasy formujące się w różnych okresach powstawania doliny. W Pieskowej Skale znajdują się one na wysokości 12 i 40 m nad współczesnym dnem, w Ojcowie na wysokości 30–40 m oraz 80 m. To na tych właśnie terasach wznoszą się Zamek w Ojcowie i Zamek w Pieskowej Skale.
W dolinie zlokalizowano ponad 30 źródeł krasowych. Przy Prądniku zlokalizowane są liczne młyny, pochodzące z XVIII w. (św. Floriana), XIX w. (Boronia, Katarzyńskich, Natkańca, Tarnówki) i z I. poł. XX w.