Oligonukleotydy łatwo wiążą się, w sposób specyficzny dla danej sekwencji, z odpowiednimi komplementarnymi oligonukleotydami DNA lub RNA, tworząc dupleksy lub, rzadziej, hybrydy wyższego rzędu.
Synteza 500px|mały|Cykl syntetyczny podczas otrzymywania oligonukleotydów metodą amidofosforynową na podłożu stałym
Syntetyczne oligonukleotydy mogą mieć budowę identyczną z naturalną lub być modyfikowane, w części fosforanowej, w pierścieniu rybozy/deoksyrybozy lub w części zasady azotowej, np. w celu uzyskania różnych efektów farmakologicznych. Modyfikacje te nadają oligonukleotydom nowe właściwości i są kluczowym elementem wykorzystania ich w terapii, np. antysensowej, jako siRNA, aptamery i in.
Oligonukleotydy są syntetyzowane chemicznie zazwyczaj zautomatyzowaną metodą amidofosforynową na podłożu stałym. Synteza przebiega w kierunku 3' do 5' i polega na stopniowym dołączaniu kolejnych reszt nukleotydowych do rosnącego łańcucha. Każdy cykl obejmuje cztery reakcje chemiczne: odblokowanie grupy 5'-hydroksylowej, kondensację (dołączenie kolejnej jednostki nukleotydowej), tzw. kapowanie (trwałe zablokowanie nieprzereagowanych grup 5'-OH) i utlenianie fosforynu do fosforanu. Po każdej z nich podłoże jest przemywane rozpuszczalnikiem w celu usunięcia produktów ubocznych i nieprzereagowanych substratów.