Podczas wojny Włoch i Prus z Austrią w 1866 roku (siedmiotygodniowej), Tegetthoff został wyznaczony dowódcą austriackiej floty, po czym podjął energiczne działania w celu jej mobilizacji i zwiększenia jej wartości bojowej. Mimo posiadania słabszej floty od włoskiej, wierzył w konieczność operacji ofensywnych i podjął wypad przeciw bazie floty włoskiej w Ankonie, jednak Włosi nie nawiązali starcia. 20 lipca 1866, w związku z atakiem floty włoskiej na wyspę Lissa (Vis), Tegetthoff poprowadził eskadrę austriacką do bitwy, w której podjął śmiałą taktykę zniwelowania włoskiej przewagi w artylerii przez walkę na bliskie odległości i taranowanie. Na skutek umiejętnej taktyki Tegetthoffa i błędów popełnionych przez Włochów, bitwa pod Lissą zakończyła się zwycięstwem Austriaków. Został on następnego dnia awansowany na stopień wiceadmirała i odznaczony przez cesarza Franciszka Józefa od razu Krzyżem Komandorskim Wojskowego Orderu Marii Teresy (z pominięciem Krzyża Rycerskiego).
Po wojnie, Tegetthoff zrezygnował z dowodzenia eskadrą i został wysłany w podróż po USA m.in. w celu zapoznania się z nowymi okrętami pancernymi.