Zespół redakcyjno-dziennikarski „Biblioteki” był silnie związany z Towarzystwem Przyjaciół Nauk, co miało istotny wpływ na treść czasopisma. Stało się przeglądem najnowszych doniesień ze wszystkich dyscyplin nauki polskiej i światowej, starając się jednak faworyzować dziedziny stosowane i historię ojczystą. Unikało jednak zagadnień bieżącej polityki. Programowo redakcja wystrzegała się określenia ideowego, co spotkało się z ostrą krytyką innych czasopism i środowisk politycznych, zarówno konserwatystów (koła petersburskie), jak i demokratów (zwłaszcza środowiska „Przeglądu Naukowego”). W praktyce wypracowało stanowisko konserwatywno-organicznikowskie, prowadząc od 60. XIX w. polemikę ideowo-wydawniczą i filozoficzną z „Przeglądem Tygodniowym”.
Do założenia „Ateneum” w 1876 było to jedyne czasopismo ogólnonaukowe w Królestwie Polskim. W latach 40. i 50. XIX redakcja periodyku stała się ważnym ośrodkiem życia kulturalnego, poprzez otwarcie jej posiedzeń dla publiczności i przedstawianie w ich trakcie odczytów popularnonaukowych i literackich. Wygłaszali je m.in. Julian Bartoszewicz, August Cieszkowski, Aleksander Przezdziecki, Fryderyk Skarbek i Gustaw Zieliński.