Jesienią 1923 rozpoczął pracę w Szkole Johna Hopkinsa (Johns Hopkins School), gdzie kontynuował badania na Wydziale Fizjologii pod okiem E. K. Marshalla i C. D. Snydera. Prowadził badania nad działaniem siatkówki, używając do tego zwierząt laboratoryjnych – żab, kotów i królików. W roku 1927 uzyskał nagrodę Johna Hopkinsa National Research Council Fellowship (Medical Sciences), co umożliwiło mu studiowanie matematyki i fizyki. Spędził dwa lata w wydziale fizyki Johna Hopkinsa biorąc kursy i pracując jako student w laboratorium A. H. Pfunda. W 1929 otrzymał stypendium od Uniwersytetu Pensylwanii, gdzie kontynuował swoje badania w fizyce. Przez jeden semestr wraz z Wernerem Heisenberg (późniejszym laureatem Nagrody Nobla) uczestniczył w seminariach na Uniwersytecie w Lipsku i dwa semestry brał udział w wykładach A. Somerfeld na Uniwersytecie w Monachium.
Wiosną 1931 Hartline wrócił do Stanów Zjednoczonych i objął stanowisko pracownika naukowego na Uniwersytecie Pensylwanii, w wydziale medycyny fizycznej pod kierownictwem Detlev W. Bronka.