Przygotowania do wojny Batalion został „skrzyknięty” w dniu rozpoczęcia mobilizacji alarmowej 24 sierpnia 1939. Po zakończeniu prac organizacyjnych batalion ON „Ostrów” (bez kompanii) z dwoma armatami przeciwpancernymi zajął stanowiska w ramach osłony garnizonu Ostrów Wielkopolski, na pozycji Wierzbno-Łąkociny. Kompania ON „Odolanów” z batalionu ON „Ostrów” zajęła stanowiska obronne w Odolanowie.
Działania bojowe Batalion rozpoczął kampanię wrześniową w składzie 25 DP.
1 września 1939 na pozycje prawego skrzydła dywizji natarcie wykonał niemiecki 183 pp Landwehry w rejonie Krotoszyna. Na odcinku zajmowanym przez batalion ON „Ostrów” i I batalion 60 pp dwa niemieckie bataliony opanowały las Nadleśnictwa Gliśnica, zbliżając się do stanowisk obu batalionów. Trwały jedynie starcia patroli rozpoznawczych. Batalion ON „Ostrów” o godz. 20.00 otrzymał rozkaz zerwania styczności z nieprzyjacielem i wycofania się po linii Daniszyn, Radłów, Pruszków, Pawłówek. Działająca oddzielnie 3 kompania ON „Odolanów” wycofała się szosą Topola Mała, Franklinów, Lewków, Kotowiecko, Skaryszewek.