Gdy powrócił w 1521 r. z rozkazem ustanowienia stałej kolonii jako gubernator Florydy, napotkał silny opór Indian, do których dotarły wieści z Południa o chciwości i okrucieństwie białych przybyszów zza oceanu (zob. Hernán Cortés). Wielu Hiszpanów zginęło, a Ponce de Leon, trafiony zatrutą strzałą w udo, został ewakuowany na Kubę, gdzie zmarł od odniesionych ran.
Konflikt z hugenotami Tragiczny koniec przedsięwzięcia Ponce’a de Leon ostudził kolonizacyjne zapędy Hiszpanów w Ameryce Północnej i spowodował przyspieszone działania eksploatacyjne w Meksyku. Jednak wkrótce powstał problem ochrony dóbr płynących z podbitego królestwa Azteków do macierzy przed atakami piratów grasujących w rejonie Morza Karaibskiego.
W 1565 r. król Filip II zlecił kapitanowi floty hiszpańskiej, Pedrowi Menendez de Avile założenie garnizonu na Florydzie w celu ochrony szlaku wodnego, oraz wyparcie francuskich hugenotów, którzy w międzyczasie założyli osadę Fort Karolina (dziś nieistniejąca, obecnie teren miasta Jacksonville) u ujścia Rzeki Św. Jana. Pedro Menendez wylądował w miejscu klęski Ponce’a, i po odprawieniu przez kapelana floty królewskiej, Mendoze, pierwszej mszy katolickiej na kontynencie północnoamerykańskim, ponownie objął Florydę w posiadanie w imieniu Korony. Wtedy też dokonał uroczystego założenia miasta St.