Aktywacja ubikwityny. jest pierwszym etapem, niezbędnym do ubikwitynacji i zachodzi poprzez dwie reakcje Enzym E1 wiąże ubikwitynę i cząsteczkę ATP i katalizuje acylo-adenylację karboksylowego końca ubikwityny. Zachodzi przeniesienie ubikwityny na łańcuch boczny cysteiny obecnej u enzymu E1, z uwolnieniem cząstęczki AMP. Powstaje wówczas wysokoenergetyczne wiązanie tioestrowe. W proteomie człowieka znane są dwa białka aktywujące ubikwitynę: UBA1 i UBA6. Przyłączenie ubikwityny do enzymu E2. Ubikwityna zostaje przeniesiona z enzymu E1 na wolną resztę cysteinową enzymu E2 w reakcji transestryfikacji. W jej trakcie E2 pozostaje połączone z E1 i ubikwityną. W proteomie człowieka znaleziono 35 białek aktywujących ubikwitynę. Ligacja ubikwityny do substratu. Ostatnim etapem jest przyłączenie ubikwityny do białka docelowego poprzez wiązanie izopeptydowe. Dochodzi do tego przy udziale enzymu E3, ligazy ubikwityny która odpowiada za rozpoznanie konkretnego substratu. W proteomie człowieka występuje ich kilkaset.
Substratami reakcji są ATP, ubikwityna i białko z lizyną obecną w sekwencji, a produktami AMP, dwufosforan i ubikwitynowane białko.