Kolejna próba, zaplanowana na 20 marca, została opóźniona o 65 minut w stosunku do planowanej godziny 23:00 GMT, z powodu problemów z komunikacją pomiędzy jednym z eksperymentów NASA znajdującym się w ładunku a systemem TDRS. Kolejna próba startu odbyła się 21 marca 2007 roku i zakończyła się przerwaniem procedury startu o godzinie 00:05 GMT, w ostatniej chwili przed oderwaniem się rakiety od stanowiska startowego, pomimo zapłonu silnika Merlin. Zdecydowano się o podjęciu drugiej próby startu jeszcze tego samego dnia. Rakieta pomyślnie opuściła stanowisko startowe o godzinie 01:10 GMT.
Rakieta funkcjonowała prawidłowo przez cały czas pracy pierwszego stopnia, jednak podczas separacji doszło do kolizji i osłona zamontowana na szczycie pierwszego stopnia uderzyła w dzwon silnika drugiego stopnia Falcona 1. Zderzenie nastąpiło w chwili, gdy dysza silnika drugiego stopnia była w momencie separacji. Pierwszy stopień obracał się znacznie szybciej, niż zakładano, co doprowadziło do kontaktu z dyszą drugiego stopnia. Według Elona Muska, uderzenie nie spowodowało widocznych uszkodzeń, stwierdził on, że zastosowanie niobowej osłony zamiast kompozytu węglowego było celowym zabiegiem, mającym na celu ograniczenie ryzyka w razie podobnych incydentów. Krótko po zapłonie drugiego stopnia, zgodnie z założeniem od dzwonu silnika oderwał się pierścień stabilizujący.