Zastosowanie Chloroheksydyna jest środkiem odkażającym stosowanym do odkażania skóry przed zabiegiem chirurgicznym (0,5% roztwór alkoholowy lub 1% roztwór wodny), do odkażania rąk (roztwory alkoholowe o stężeniu do 4%) lub (rzadziej) do odkażania ran (zwłaszcza oparzeniowych – 0,5% roztwór wodny). Roztwór 1:5000 stosowany jest do krótkotrwałego przechowywania wyjałowionych narzędzi. Jest również używana jako aktywny składnik płukanek i żelów doustnych (o stężeniu odpowiednio 0,1% i 0,2%), mających na celu zniszczenie bakterii próchnicotwórczych zawartych głównie w płytce nazębnej. Kremy z dodatkiem chloroheksydyny stosuje się w leczeniu trądziku i gronkowcowych zakażeniach skóry. Do przepłukiwania pęcherza moczowego podczas cystoskopii stosuje się 0,02% roztwór wodny. Przy zabiegach ginekologicznych i położniczych stosuje się roztwory wodne o stężeniu 0,02–0,05%.
Warunkiem rozwinięcia działania jest przynajmniej 5-minutowy kontakt tkanek z substancją leczniczą.
Przeciwwskazania Chloroheksydyna jest przeciwwskazana przy zabiegach mogących doprowadzić do wprowadzenia substancji do płynu mózgowo-rdzeniowego (zabiegi w obrębie OUN, niektóre otorynolaryngologiczne).