W 1320 włączony został do Wielkiego Księstwa Litewskiego, gdy zmarł ostatni książę Jarosław Wasilkowicz, którego córka Maria została wydana za wielkiego księcia litewskiego Olgierda. Księstwo stało się dla Olgierda, po śmierci Giedymina, oparciem w walce z braćmi o władzę nad Wielkim Księstwem Litewskim. Po odniesionym wspólnie z Kiejstutem zwycięstwie, Olgierd zlikwidował w latach 40. XIV w. Księstwo Witebskie i włączył je do Litwy i od tej pory ziemia witebska zarządzana była przy pomocy namiestników książęcych. W 1494 roku król Aleksander Jagiellończyk nadał tamtejszej farze przywilej nadający dziesięcinę.
Król Aleksander w 1503 roku uczynił Witebsk stolicą województwa oraz nadał miastu swobodę wyznania i prawo wyboru wojewody „wedle starego obyczaju, kogo Witebszczanie zapragną”. W 1563 r. został przejściowo zajęty przez Moskwę. Od 1569 na mocy unii lubelskiej wraz z Wielkim Księstwem Litewskim część składowa Rzeczypospolitej Obojga Narodów. Za panowania króla Stefana Batorego rozbudowano zamek. Witebsk w tym czasie został miejscem sejmików i sądów ziemskich. W 1597 Witebsk otrzymał od króla Zygmunta III Wazy prawa miejskie i herb z chustą św. Weroniki przedstawiający twarz Chrystusa na błękitnym polu z czerwonym mieczem. W 1602 roku mieszczanie obronili miasto z zamkiem i pojmali atakujących kozaków Dubiny.