22 kwietnia sformalizowano umowę małżeńską pomiędzy Manuelem a Izabelą i Ferdynandem. Problemem był zakaz kościelny, który zabraniał zawierania ślubu pomiędzy wdowcem a siostrą zmarłej żony. Po negocjacjach pomiędzy papieżem i hiszpańskimi ambasadorami 24 sierpnia 1500 papież Aleksander VI udzielił dyspensy. W zamian jego kuzyn – Ludwik Borgia został arcybiskupem Walencji.

Ślub Manuela I i Marii miał miejsce 30 października 1500 roku w Alcácer do Sal.

Zmarła 6 marca 1517 roku, dwa miesiące przed śmiercią jej matki. Przyczyną zgonu prawdopodobnie był nowotwór. Pochowana jest w głównej kaplicy Klasztoru Hieronimitów razem ze swoim mężem, Manuelem I.

Potomstwo Maria urodziła Manuelowi 9 dzieci:

6 czerwca 1502 r. urodził się pierwszy syn Marii – Jan, następca Manuela i następny król Portugalii, 24 października 1503 r. urodziła się Izabela – żona cesarza rzymskiego, Karola V Habsburga, 31 grudnia 1504 r. urodziła się Beatrycze – księżna Sabaudii poprzez ślub z Karolem III Dobrym, 3 marca 1506 r. urodził się Ludwik – książę Beja,

5 czerwca 1507 r. urodził się Ferdynand – książę Guarda, mąż hrabiny Marialvy, Guiomary Coutinho,