Od 1602 w monasterze obowiązywała cenobityczna reguła życia mniszego, wspólnota miała również prawo zatrudniania świeckich pracowników.
W 1603 kierownictwo dermańskiej drukarni objął Damian (Demian) Nalewajko, brat przywódcy kozackiego Seweryna (Semena) Nalewajki, który następnie przyjął w klasztorze święcenia kapłańskie. Mnisi uczyli się greki, łaciny i języka cerkiewnosłowiańskiego oraz zajmowali się przekładami. W zamyśle fundatorów i kolejnych pokoleń prawosławnego rodu Ostrogskich monaster miał stanowić jedno z intelektualnych centrów tego wyznania w Rzeczypospolitej.
Klasztor unicki
Po śmierci Konstantego Wasyla Ostrogskiego i konwersji na katolicyzm wszystkich jego potomków monaster w Dermaniu stracił dotychczasowych protektorów. Córka Ostrogskiego, Anna Alojza Chodkiewicz, i spadkobierca ordynacji ostrogskiej Aleksander Zasławski czynili starania na rzecz przyjęcia przez klasztor unii. Ostatecznie do przyłączenia monasteru do Kościoła unickiego doszło w 1635. Jego przełożonym był wówczas Melecjusz Smotrycki, wyświęcony na biskupa połockiego przez patriarchę jerozolimskiego Teofana III w 1620.