Jego rodzice poznali się na zajęciach malarstwa i zamieszkali w nowojorskiej dzielnicy Greenwich Village, wynajmując mieszkanie na poddaszu jednego z budynków. Wkrótce po jego urodzeniu znaleźli się w stanie separacji, a w 1945 się rozwiedli. Ojciec opuścił matkę i wówczas 3-letniego Roberta juniora, gdy zdał sobie sprawę, że jest gejem, pozostał jednak obecny w życiu syna przez całe życie. Robert De Niro pośmiertnie zadedykował mu wyreżyserowany przez siebie film Prawo Bronxu (A Bronx Tale, 1993).
De Niro dorastał na obszarze nowojorskiego Manhattanu, zwanym Małymi Włochami (ang. Little Italy), wychowywany przez matkę. Dołączył do ulicznego gangu, zyskując przydomki „Bobby Milk” i „Robden”. Przez sześć lat uczęszczał do Public School 41, publicznej szkoły podstawowej na Manhattanie. Brał lekcje aktorstwa w Dramatic Workshop i w wieku dziesięciu lat zadebiutował na scenie w roli tchórzliwego lwa w inscenizacji L. Franka Bauma Czarnoksiężnik z Krainy Oz. Uczył się w Elisabeth Irwin High School i Little Red School House. Przez krótki czas uczęszczał do Liceum Muzyki i Sztuki, zanim przeniósł się do publicznego liceum IS 71, Charles Evans Hughes Junior High School. Następnie naukę kontynuował w McBurney School, a później w Rhodes Preparatory School.