30 sekund dobrze spłukać preparat wodą destylowaną i po wyschnięciu oglądać pod mikroskopem
Mechanizm barwienia Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie fioletowe. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1–2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik. Możliwe też, że kompleks fiolet-jod łączy się trwale z kompleksem rybonukleinianu magnezu (niedobór magnezu może powodować barwienie na czerwono bakterii zasadniczo Gram-dodatnich) i zasadowego białka, które są obecne w ścianie bakterii Gram-dodatnich w dużych ilościach lub bardziej ujemnie naładowana (inny punkt izoelektryczny) ściana Gram-dodatnich silniej wiąże zasadowy fiolet. Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są fioletowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne. Dodatkowy barwnik (np.