Sekwencje polimorficzne RFLP, które wykrywa się tą metodą, są używane jako znaczniki zarówno w mapach fizycznych, jak i genetycznych.
Jest to metoda, która pozwala na wykazanie powiązań rodzinnych poprzez porównywanie charakterystycznych wzorów polimorficznych, które są otrzymywane, gdy określone regiony łańcucha DNA są powielane (szczególnie przy użyciu techniki PCR) i pocięte przez określone enzymy restrykcyjne.
RFLP jest kluczowym narzędziem w rozpoznawaniu DNA, określaniu obecności różnych alleli u osobników. Mapowanie polimorficznych długości fragmentów restrykcyjnych jest także używane w hodowli roślin po to, by wykazać czy cecha, taka jak np. odporność na suszę, została odziedziczona. Podobnie jeżeli polimorfizm zostaje wykryty w pobliżu miejsca, gdzie występuje defekt genetyczny, RFLP jest wartościowym znacznikiem pokazującym drogę dziedziczenia tego defektu.
W szczególności dana osoba może być zidentyfikowana dzięki tej metodzie przy badaniu pozostałości krwi, włosów i nasienia i w związku z tym RFLP jest szeroko używana w kryminalistyce. Z wyjątkiem bliźniąt jednojajowych metoda ta pozwala na niemalże pewne odróżnianie poszczególnych osób.