Jest ona silnie zróżnicowana pod względem składu białkowego, które pełnią różne funkcje: białka łańcucha transportu elektronów, biorące udział w reakcjach redoks, w tym fosforylacji oksydacyjnej syntaza ATP wytwarzająca ATP w macierzy mitochondrialnej białka transportujące inne białka białka transportujące metabolity.
W jej skład wchodzi ponad 150 polipeptydów; ma także wysoki stosunek białek do fosfolipidów (ponad 3:1 wagowo, co oznacza, że 1 białko przypada na 15 fosfolipidów). Są to białka łańcucha oddechowego, syntaza ATP wytwarzająca ATP w macierzy mitochondrialnej oraz białka transportujące metabolity do wnętrza macierzy i na zewnątrz. Stanowią one około 20% wszystkich białek mitochondrium. Błona wewnętrzna, w przeciwieństwie do błony zewnętrznej, nie zawiera poryn i jest nieprzepuszczalna dla wszystkich cząsteczek. Posiada ona jednakże w swojej strukturze nietypowy fosfolipid, kardiolipinę. Związek ten, odkryty po raz pierwszy w krowim sercu w 1942, jest charakterystyczny dla błon bakterii i mitochondrium. Kardiolipina zawiera w swojej strukturze cztery wyższe kwasy tłuszczowe zamiast dwóch. Jej funkcją jest prawdopodobnie uniemożliwianie przepływu jonów przez błonę lub utrzymywanie w całości białek łańcuch oddechowego za pomocą oddziaływań hydrofobowych.