Król Stefan Batory, który u schyłku życia obrał Grodno za swoją siedzibę, polecił wznieść nową, tym razem murowaną świątynię. Według zachowanych materiałów zakonu jezuitów, nowa świątynia (z cegły) została zbudowana w latach 1584–1587 w stylu postgotycko-manierystycznym, zaś autorem projektu najprawdopodobniej był włoski architekt Antonio Greppi del Ronco i królewski architekt Józef RoitenMateriały do dziejów sztuki sakralnej na ziemiach wschodnich Rzeczypospolitej, Część IV, Tom 4 (red. naukowa Maria Kałamajska-Saeed), Kościoły Grodna, wyd. Międzynarodowe Centrum Kultury, Kraków 2018, s.32. Po wybudowaniu kościoła murowanego rozebrano stary kościół drewnianyMateriały do dziejów sztuki sakralnej na ziemiach wschodnich Rzeczypospolitej, Część IV, Tom 4 (red. naukowa Maria Kałamajska-Saeed), Kościoły Grodna, wyd. Międzynarodowe Centrum Kultury, Kraków 2018, s.17. W 1592 roku przy południowej nawie zbudowano kaplicę grobową Chaleckich, którą ufundował Dymitr Chalecki, podskarbi wielki litewski.