Leonardo malował obraz między 1494 lub 1495 a 1498 rokiem. Według relacji Giorgio Vasariego Leonardo da Vinci pracował nad malowidłem nieregularnie. Mając gotową wizję potrafił pracować przez kilkanaście godzin dziennie, zapominając o przerwie na posiłek. Po okresie ciężkiej pracy przez dłuższy czas nie malował, ograniczając swoją pracę do obserwowania obrazu i szukania najlepszych rozwiązań. Zdarzało mu się również nagle biec do klasztoru, by dokonać drobnych poprawek. Wolne tempo prac nad fryzami dekoracyjnymi dookoła malowidła wiązały się z prowadzonymi wówczas przez Leonarda studiami matematycznymi. Prace nad obrazem śledzili na bieżąco duchowni i mieszkańcy Mediolanu. Leonardo słuchał krytycznych uwag ze strony obserwujących i niekiedy dostosowywał się do nich. Według fałszywej anegdoty Leonardo miał spotkać się z francuskim biskupem Raymondem Perauldem, który widział prace nad malowidłem. Po odejściu kardynała Leonardo miał zwrócić uwagę, że wielcy artyści zawsze byli szanowani nawet przez barbarzyńców.