Życiorys Janusz Ostrogski był synem Konstantego Wasyla i Zofii z Tarnowskich, wnukiem hetmana Konstantego Ostrogskiego. Kształcił się w ojcowskim Dubnie i na dworze wiedeńskim. W 1577 dowodził obroną Dubna przed Tatarami. W 1579 wraz z ojcem wziął udział w kampanii inflanckiej. W tym samym roku przeszedł, jako pierwszy przedstawiciel rodu, na katolicyzm, co pogorszyło jego stosunki z rodziną.
W latach 1584–1593 wojewoda wołyński. W 1587 podpisał elekcję Maksymiliana III Habsburga. W 1589 był sygnatariuszem traktatu bytomsko-będzińskiegoCodex diplomaticus Regni Poloniae et Magni Ducatus Lituaniae, wydał Maciej Dogiel, Wilno 1758, t. I, s. 231.. W 1593 został kasztelanem krakowskim. 2 lutego tegoż roku, wspólnie z Aleksandrem Wiśniowieckim pokonał w bitwie pod Piątkiem zbuntowanych Kozaków, którymi dowodził Krzysztof Kosiński. W kwietniu 1606 roku uczestniczył w zjeździe w StężycyStanisław Płaza, Rokosz Zebrzydowskiego, Kraków 1989, s. 4.. W 1607 walczył po stronie wiernej królowi Zygmuntowi III przeciwko rokoszanom Zebrzydowskiego w bitwie pod Guzowem. W 1609 z części swych dóbr utworzył Ordynację Ostrogską.