Był rektorem seminarium archidiecezjalnego w Neapolu oraz regionalnym radcą Akcji Katolickiej.
23 marca 1989 został mianowany biskupem pomocniczym Neapolu, ze stolicą tytularną Tortibulum. Sakrę biskupią otrzymał 13 maja 1989 w Neapolu z rąk miejscowego metropolity, kardynała Michele Giordano. 19 listopada 1999 został biskupem diecezji Albano (będącej jednocześnie tradycyjną diecezją kardynalską). 27 maja 2004 przeszedł do pracy w Kurii Rzymskiej; został prefektem Trybunału Sygnatury Apostolskiej, jednocześnie otrzymał promocję na arcybiskupa tytularnego.
22 lutego 2006 znalazł się w gronie piętnastu duchownych, których nominacje kardynalskie zapowiedział papież Benedykt XVI, a na uroczystości konsystorza 24 marca 2006 otrzymał tytuł kardynała diakona San Pier Damiani ai Monti di San Paolo.
27 czerwca 2008 papież Benedykt XVI mianował kard. Agostino Valliniego wikariuszem generalnym Rzymu i archiprezbiterem bazyliki laterańskiej. Na dotychczasowym stanowisku zastąpił go arcybiskup Saint Louis Raymond Leo Burke.
24 lutego 2009 promowany przez papieża do rangi kardynała prezbitera.
1 maja 2011 podczas uroczystej eucharystii na placu św. Piotra, jako wikariusz generalny Rzymu prosił papieża Benedykta XVI o włączenie Jana Pawła II w poczet błogosławionych.