W 1562 roku podpisano edykt z Saint-Germain, który dawał wolność hugenotom w wyznawaniu wiary publicznie na wsiach i prywatnie w miastach. Opozycyjni katolicy rozpoczęli rozbijanie hugenockich nabożeństw. Parlament paryski miał oficjalnie odrzucić edykt, ale na wsiach często górę brali protestanci. Szczególnie ważnym incydentem była masakra w Wassy w 1562 roku, w której z inicjatywy Franciszka Gwizjusza doszło do mordu na ponad siedemdziesięciu hugenotach. Wydarzenie to było pretekstem do pierwszej wojny religijnej.
W 1572 pod wpływem matki i Gwizjuszów przyzwolił na krwawą rozprawę z hugenotami w Paryżu. Doszło do niej w nocy z 23 na 24 sierpnia (tzw. noc św. Bartłomieja), gdy żołnierze królewskiej gwardii szwajcarskiej znienacka napadli i przy współudziale podburzonego tłumu paryżan w ciągu dwu dni zabili około 3 tys. protestantów (w tym wielu szlachciców) przybyłych na ślub przywódcy hugenotów, Henryka Burbona, króla Nawarry, z siostrą Karola, Małgorzatą de Valois (nazywaną przez rodzinę Margot).
Karol IX zmarł na gruźlicę. Przed śmiercią wezwał swojego szwagra Henryka Burbona, objął go i pożegnał jak najlepszego przyjaciela, a następnie prosił, aby zaopiekował się Marią Touchet i synem Karolem.