Pierwsze plany utworzenia parku narodowego na terenie Białowieży powstały w 1916 roku, głównie z inicjatywy gdańskiego botanika i jednego z twórców ruchu ochrony przyrody, doktora Hugo Conwentza. Nie zyskały one wówczas dużego poparcia. Idea ochrony chociaż części puszczy powróciła w 1919 roku, podczas liczenia białowieskich żubrów. Jej orędownikami byli wtedy polski botanik, profesor UJ, Władysław Szafer, profesor Eugeniusz Kiernik oraz inżynier Jan Kloska. Wysiłki te, tak jak i poprzednie, okazały się bezowocne.
29 grudnia 1921 roku na terenie Puszczy Białowieskiej, z inicjatywy i dzięki usilnym staraniom grona polskich przyrodników i leśników z profesorem Władysławem Szaferem na czele, Ministerstwo Rolnictwa i Dóbr Państwowych na mocy decyzji z 29 grudnia 1921 roku wydzieliło leśnictwo, które 13 kwietnia 1924 roku zostało podniesione do rangi nadleśnictwa o tej samej nazwie. Jako rezerwat ścisły uznano oddziały leśne o numerach: 258, 288, 289, 319 i 344. Oddziały położone w widłach rzek Narewki i Hwoźnej i kilka oddziałów z byłego nadleśnictwa Zwierzyniec uzyskały charakter rezerwatu częściowego. W 1923 roku kierownictwo Rezerwatu objął Józef Paczoski, który rozpoczął w nim prace badawcze. 9 września 1928 roku kierownictwo objął dr Jan Jerzy Karpiński.