Po ukończeniu szkoły średniej w 1890 roku, w wieku 20 lat i otrzymaniu świadectwa z fizyki i matematyki, Montessori zdecydowała się studiować medycynę, co także łamało ówczesne normy kulturowe.
W 1890 roku rozpoczęła studia na La Sapienza. Zdobyła Diploma di licenza w 1892 roku. Stopień ten, wraz z dodatkowymi kursami z języka włoskiego i łaciny, kwalifikował ją do rozpoczęcia studiów medycznych na uniwersytecie w 1893 roku.
Życie prywatne 31 marca 1898 urodziła swoje jedyne dziecko – syna Mario Montessori (31 marca 1898 – 1982). Ojcem dziecka był Giuseppe Montesano, jej kolega lekarz, który był z nią wspólnie dyrektorem rzymskiej Szkoły Ortoforycznej. Gdyby Montessori wyszła za niego za mąż, wówczas oczekiwano by od niej, że przestanie pracować zawodowo. Montessori postanowiła zrezygnować z małżeństwa, a w zamian za to kontynuować pracę i studia. Montessori chciała zachować w tajemnicy związek z ojcem jej dziecka, pod warunkiem, że żadne z nich nie poślubi nikogo innego. Kiedy ojciec jej dziecka został zmuszony przez rodzinę, aby korzystnie ożenił się, Montessori poczuła się zdradzona i postanowiła opuścić szpital uniwersytecki. W tym czasie oddała syna pod opiekę mamy mieszkającej na wsi. Mimo wyboru pracy, była zrozpaczona, że nie może uczestniczyć w pierwszych latach jego życia.