W końcu XV w. Choroszcz z włością stała się własnością bojara z Kijowszczyzny, wojewody Iwana Chodkiewicza. Jego syn Aleksander gospodarzył w swych włościach z rozmachem, karczując puszczę, budując młyny, folusze, osadzając osadników z Rusi i Mazowsza. Z czasem w dobrach Chodkiewiczów powstały Ruszczany, Zastawie, Sienkiewicze, Barszczewo, Jeroniki, Żółtki, młyny młynarzy Dzikich w miejscowości Dzikie. W 1506 Aleksander nadał Choroszcz z włością klasztorowi w Supraślu. Mnisi wznieśli tu cerkiew i otaczali opieką duszpasterską ludność wiary greckiej. W 1533 Choroszcz powróciła do Chodkiewiczów. Dzięki staraniom Aleksandra w 1507 Choroszcz otrzymała od króla Zygmunta I prawa miejskie z obowiązkiem dostarczania drużyny zbrojnej na wypadek wojny.
W XVI wieku miasto rozwijało się intensywnie. Z połowy XVI w. pochodzą pierwsze wzmianki o osadnikach żydowskich. Choroszcz była wówczas centrum okolicznych dóbr, a trakty łączyły ją ze znaczniejszymi ośrodkami Podlasia. Odbywały się tu targi, odpusty, kwitło życie religijne. Pod koniec XVI wieku Choroszcz była miastem liczącym ok. 200 domów i 1200 mieszkańców. W 1587 Anna Chodkiewiczówna wniosła w posagu dobra choroskie Pawłowi Pacowi.