Przed filmową i telewizyjną kamerą Miloslav Holub zaczął pojawiać się w filmie od drugiej połowy lat 40. XX wieku i podczas swojej długiej kariery stworzył w nim ok. czterdzieści ról. Po raz pierwszy przedstawił się publiczności filmowej jako członek Teatru Narodowego Czech Wschodnich w Pardubicach. Został napisany w 1947 roku, a reżyser Jiří Weiss obsadził go w roli morderczego poczmistrza Johanna Zeislera w dramacie wojennym Uloupená hranice. Inne oferty ze studia Barrandov nie trwały długo. Po mniejszych rolach w filmach Pan Habětín odchází (1949), Poslední výstřel (1950) i Zocelení (1950), reżyser Martin Frič zaproponował mu kolejną interesującą i ponownie negatywną rolę gestapowca Antona Dönnerta w filmie Past (1950). Potem pojawiło się kilka mniej lub bardziej interesujących ról filmowych. Kolejną znaczącą rolą był leśniczy Paleček, tytułowa postać w filmie Przez zieloną granicę (1959) w reżyserii Karel Kachyňy.