Muzeum oficjalnie otwarto dla publiczności w listopadzie 1819 roku.
Głównym jego celem było ukazywanie sztuki należącej do korony królewskiej i pokazanie, że sztuka hiszpańska nie odbiega poziomem od dyscyplin artystycznych realizowanych w innych krajach Europy. W 1868 roku Izabelę II zdetronizowano, a muzeum upaństwowiono i zmieniono nazwę na Narodowe Muzeum Prado (hiszp. Museo Nacional del Prado).
W międzyczasie kolekcja muzeum rosła, wzbogacając się w dużej mierze dzięki konfiskatom Mendizabala – projektowi konfiskaty niedochodowych ziem kościelnych, która prowadziła do zamykania niedochodowych klasztorów, a przez to przejmowania ich własności, w tym dzieł sztuki. Budynek mieszczący królewskie zbiory sztuki z czasem okazał się niewystarczający do prezentacji kolekcji, więc w 1918 roku podjęto decyzję o jego rozbudowie.
W okresie Drugiej Republiki Hiszpańskiej od 1931 do 1936 roku skupiono się na budowaniu prowincjonalnych muzeów. Podczas hiszpańskiej wojny domowej, na podstawie zlecenia Ligi Narodów, usunięto 353 obrazy i 168 rysunków, które wysłano do Walencji, następnie do Girony i do Genewy. W pierwszych latach dyktatury Francisca Franco wiele obrazów zostało umieszczonych w ambasadach.