Zasada działania Sondy TaqMan składają się z fluoroforu kowalencyjnie przyłączonego do końca 5' sondy oligonukleotydowej i wygaszacza na końcu 3'. Dostępnych jest kilka różnych fluoroforów (np. 6-karboksyfluoresceina, akronim: FAM lub tetrachlorofluoresceina, akronim: TET) i wygaszaczy (np. tetrametylorodamina, akronim: TAMRA)TaqMan Probes: Introduction, functioning and applications. Cząsteczka wygaszacza gasi fluorescencję emitowaną przez fluorofor, gdy jest wzbudzana przez źródło światła cyklera poprzez transfer energii rezonansowej Förstera (FRET). Dopóki fluorofor i wygaszacz są w pobliżu, wygaszanie hamuje wszelkie sygnały fluorescencji.
Sondy TaqMan są zaprojektowane w taki sposób, że hybrydyzują w rejonie DNA amplifikowanym przez określony zestaw starterów. Sonda wiąże się z jednoniciowym DNA. Sondy TaqMan mogą być sprzężone z ugrupowaniem mniejszego rowka wiążącego (MGB), tripeptydem dihydrocyklopiroloindolowym (DPI3), w celu zwiększenia jego powinowactwa wiązania do szukanej sekwencji. Sondy sprzężone z MGB mają wyższą temperaturę topnienia (Tm) z powodu zwiększonej stabilizacji sił van dar Waalsa. Ponieważ polimeraza Taq rozszerza starter i syntetyzuje powstającą nić (na matrycy jednoniciowej), aktywność egzonukleazy polimerazy Taq degraduje sondę, która odłączyła się do matrycy.